Robert De Niro Jr., 17 Ağustos 1943 de New York’da sanatkar bir ailenin çocuğu olarak dünyaya geldi. Annesi Virginia Admiral bir ressam, babası Robert ise hem bir ressam hem de şairdi. De Niro’nun çocukluğu özgür ve yalnız geçti. New York’daki İtalyan mahallesinde, sıskalığından dolayı “Bobby Milk” diye bilinirdi. Utangaç bir çocuk olan De Niro, romanları her zaman arkadaşlara tercih etti. Bu ürkekliğini 10 yaşında rol aldığı Wizard of Oz oyununda, aslan karakterini oynayarak yendi.
Çocukluğunun büyük bölümünü sokaklarda küçük çetelerle geçirdi. Oyunculuk ağır bastığında ilk rolü 16 yaşında oynadığı Chekhov’un The Bear filmi oldu. O zamandan itibaren 15 yıl boyunca lokantalarda ve ufak sahnelerde oyunlar oynadı.
Kamerayla ise 1968 yılında çekilen Greetings filmiyle tanıştı.